Cannabidiol hemmt neuroinflammatorische Reaktionen und Schaltkreise

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7907 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das nicht euphorisierende Phytocannabinoid Cannabidiol (CBD) wird erfolgreich zur Behandlung von Epilepsien im Kindesalter eingesetzt. Diese Erkrankungen sind mit Entwicklungsverzögerungen verbunden, die häufig auch das Erlernen der Stimme betreffen. Der Gesang von Zebrafinken ist wie die Sprache ein komplexes Verhalten, das während einer sensiblen Entwicklungsphase erlernt wird. Die Songqualität wird durch kontinuierliche sensomotorische Verfeinerung unter Einbeziehung von Schaltkreisen aufrechterhalten, die das Lernen und die Produktion steuern. Innerhalb des stimmmotorischen Schaltkreises ist HVC eine kortikale Region, die bei teilweiser Läsion die Gesangsstruktur vorübergehend stört. Wir haben zuvor festgestellt, dass CBD (10 mg/kg/Tag) die Stimmerholung nach einer Läsion verbessert. Die vorliegenden Studien wurden durchgeführt, um die Mechanismen zu verstehen, die möglicherweise für den Stimmschutz von CBD verantwortlich sind. Wir fanden heraus, dass CBD die Expression von Entzündungsmediatoren und Markern für oxidativen Stress deutlich reduzierte. Diese Effekte waren mit einer regional verringerten Expression des Mikroglia-Markers TMEM119 verbunden. Da Mikroglia Schlüsselregulatoren der synaptischen Reorganisation sind, haben wir die Synapsendichten gemessen und dabei erhebliche, durch Läsionen verursachte Abnahmen im gesamten Schaltkreis festgestellt, die durch CBD weitgehend umgekehrt wurden. Der synaptische Schutz ging mit der NRF2-Aktivierung und der BDNF/ARC/ARG3.1/MSK1-Expression einher, was Mechanismen impliziert, die für die Abschwächung von oxidativem Stress durch Song-Schaltkreisknoten und die Förderung der synaptischen Homöostase wichtig sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass CBD eine Reihe neuroprotektiver Prozesse fördert, die mit der Modulation mehrerer Zellsignalsysteme einhergehen, und legen nahe, dass diese Mechanismen für die Wiederherstellung eines komplexen erlernten Verhaltens nach einer Läsion wichtig sind.

Cannabis und viele der bioaktiven Moleküle, die es produziert, werden seit Jahrzehnten untersucht1. Diese Bemühungen führten zur Identifizierung von Hunderten von Phytocannabinoiden, von denen zwei als Therapeutika herausragen: Cannabidiol (CBD) und Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC). Bis vor kurzem wurde das Interesse an CBD durch die Konzentration auf das dramatischer wirksame und euphorisierende THC in den Schatten gestellt. Subtiler wirkendes CBD erhält jetzt erhöhte therapeutische Aufmerksamkeit, da eine aus Pflanzen gewonnene Formulierung in den USA für die Vermarktung zur Behandlung von Anfallsleiden bei Kindern zugelassen wurde2.

Diese Anfallsleiden gehen mit einer verzögerten Sprachentwicklung ein3. Befragungen von Betreuern aus Epilepsiestudien bei Kindern legen nahe, dass CBD die stimmliche Kommunikation verbessert4,5. Um den möglichen Nutzen von CBD bei Sprech- und Sprachstörungen zu untersuchen, haben wir einen stimmlernenden Singvogel, den Zebrafinken, als präklinisches Tiermodell verwendet.

Wie die menschliche Sprache wird auch das Lied in einer sensiblen Entwicklungsphase erlernt6. Ebenso wie beim Menschen hängt das Gesangslernen von Singvögeln vom Aufbau von Schaltkreisen ab, die kortikale, striatale und thalamische Gehirnregionen verbinden7. Genexpressionsprofile zeigen deutliche Ähnlichkeiten zwischen dem Gesangslernen von Singvögeln und Menschen8,9 und motorischen Regionen10. Beispielsweise gibt es Belege für funktionelle Ähnlichkeiten zwischen den Schichten 2, 3 und 6 des menschlichen laryngealen motorischen Kortex (LMC) und dem Singvogel-HVC (richtiger Name), die jeweils die stimmmotorische Leistung steuern (von LMC-Schicht 5 und dem robusten Singvogelkern des Arcopalliums [RA]). , bzw.9).

Zuvor haben wir bei der Verwendung einer bilateralen HVC-Mikroläsionsmethode zur Störung der Lautäußerungsqualität11 festgestellt, dass tägliche Behandlungen mit 10 mg/kg CBD das Ausmaß der Gesangsstörung verringern und die Erholungszeit verbessern12. Für die vorliegende Studie haben wir einen einseitigen Läsionsansatz gewählt, um die Auswirkungen auf die Tiere zu reduzieren und statistisch aussagekräftige Kontrollen innerhalb des Probanden zu ermöglichen. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass unilaterale HVC-Mikroläsionen wie die bilaterale Methode Gesangsmuster reversibel stören, allerdings mit einem geringeren Wirkungsausmaß. Darüber hinaus stellten wir fest, dass Mikroläsionen in der linken Hemisphäre eine stärkere Stimmstörung hervorriefen als Mikroläsionen in der rechten Hemisphäre, was mit der von anderen berichteten Stimmlateralisierung bei Singvögeln übereinstimmt13. Beachten Sie, dass die Genesung von der Hörwahrnehmung abhängt (betäubte Vögel verbessern sich nicht14), weshalb bei Erwachsenen ein sensomotorisches Umlernen erforderlich ist. Unser aktuelles Ziel ist es, das Verständnis der Mechanismen zu verbessern, durch die CBD die Stimmqualität schützt und die lernabhängige Wiederherstellung eines komplexen motorischen Verhaltens verbessert.

Es häufen sich Beweise dafür, dass CBD eine entzündungshemmende und antioxidative Stressaktivität hat, die die Aktivierung von Immunzellen und die Migration in Bereiche mit ZNS-Verletzungen beinhaltet15. Eine Genexpressionsstudie mit Microarray-basierter Genprofilierung zeigt beispielsweise, dass CBD mehrere zelluläre Ereignisse abschwächt, indem es die Expression entzündungsfördernder Transkriptionsfaktoren, Zytokine und Zytokinrezeptoren moduliert (die insbesondere von Mikroglia freigesetzt und vom Haupt-Antioxidansregulator gesteuert werden). , NRF216,17). Neuere RNASeq-Experimente zeigen eine durch CBD veränderte Expression von Immunmediatoren im präfrontalen Kortex und wahrscheinlich eine damit verbundene kognitive Verbesserung in einem Schizophreniemodell bei Ratten18. In einem Alzheimer-Mausmodell stimuliert CBD die entzündungshemmende Wirkung des Hippocampus und fördert die Expression des homöostatischen Autophagie-Gens19. Angesichts dieser Beispiele entzündungshemmender CBD-Aktivität vermuteten wir die Beteiligung ähnlicher Mechanismen an der Stimmerholung. Um diese Möglichkeit zu testen, untersuchten wir die CBD-Modulation der Post-Mikroläsion-Expression von entzündlichen Zytokinen, Markern für neuronalen oxidativen Stress, Mikroglia-/Makrophagen-Infiltration und damit verbundenen Veränderungen der synaptischen Dichte in relevanten Gesangskontrollregionen (Abb. 1).

Zusammenfassung der interessierenden Gesangshirnregionen. (A) Schematische Darstellung der fokussierten Gehirnregionen und ihrer Verbindungen. Mikroläsionen zielen auf HVC ab und führen zu Stimmdefiziten, deren Erholung vom sensomotorischen Lernen abhängt (taube Vögel erholen sich nicht14). Rote Pfeile stellen den vorderen Vorderhirnweg (AFP) dar, einen Cortico-Basalganglien-Thalamus-Kreislauf, der für das Stimmlernen und die Induktion von Stimmvariabilität im Erwachsenenalter von entscheidender Bedeutung ist. Grüne Pfeile stellen Stimmmotorbahnen dar. Gestrichelte Regionen geben ungefähre x- und y-Positionen von Regionen an, die in Panel B nicht sichtbar sind. (B) Ist ein repräsentatives Dunkelfeldbild, das verwendet wird, um Abschnitte mit interessierenden Regionen zu identifizieren und ihre Grenzen für die Überlagerung mit Bildern zu definieren, die später mittels konfokaler Mikroskopie erhalten wurden. Dieses Bild wurde verwendet, um die Camera-Lucida-artige Nachzeichnung in Bild A zu erstellen. Beachten Sie, dass die ausgeprägte Kernorganisation der Gesangsregionen im Kontrast zum laminierten Säugetier-Kortex steht und das Anvisieren für Läsionen, Dissektionen und andere Manipulationen ermöglicht. Rostral ist ungefähr rechts, dorsal nach oben, und Balken = 1 mm. Abkürzungen: HVC (Eigenname), lMAN (lateraler magnozellulärer Kern des anterioren Nidopalliums), RA (robuster Kern des Arcopalliums), Area es vom Striatum von Säugetieren, das diese Merkmale trennt20).

In anderen Systemen zeigt CBD eine entzündungshemmende und antioxidative Wirksamkeit, die teilweise für seine neuroprotektive Aktivität verantwortlich ist21,22. Um zu beurteilen, ob eine durch CBD verbesserte Stimmwiederherstellung eine ähnliche entzündungshemmende Wirksamkeit mit sich bringen könnte, haben wir die Expression mehrerer entzündungsfördernder und entzündungshemmender Mediatoren quantifiziert (Abb. 2A–D). Unter Verwendung der Mikro-Punch-Dissektionstechnik (unten beschrieben) isolierten wir 24 Stunden nach Mikroläsionen Gewebe für die RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und Amplifikation aus Gesangsregionen innerhalb der Knoten motorischer (HVC und RA) und lernender essentieller Schaltkreise (Bereich X, beachten Sie die Mikro-Punch-Dissektion). Der verwendete Ansatz ist in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt. ANOVA mit gemischten Modellen ergab, dass CBD-Behandlungen die Expression der proinflammatorischen Mediatoren IL-6 (im Vergleich zu den Vehikelkontrollen) deutlich reduzierten (im Mittelwert innerhalb von HVC = 0,615 [0,243–0,987], p = 0,0002; IL-1Β (im Mittelwert im HVC). = 1,33 [0,427–2,222], p = 0,0015; und RA im Mittel = 1,44 [0,542–2,337], p = 0,0005; RA im Mittel = 0,563 [0,192–0,935], p = 0,0008; und Fläche X im Mittel = 0,435 [0,063–0,807], p = 0,0141, siehe Abbildung 2A–C). 0,292 [0,105–0,48], p = 0,0008), was in Bereich Es wurde auch gezeigt, dass es das entzündungshemmende Zytokin IL-1023 hochreguliert. Wir haben Unterschiede in der IL-10-Expression quantifiziert und festgestellt, dass sie im HVC von mit CBD behandelten Vögeln signifikant erhöht sind (Mittelwert = 0,512 [0,152–0,872, p = 0,0023). und RA (Mittelwert = 0,487 [0,127–0,846], p = 0,004), jedoch nicht in Bereich X (Mittelwert = 0,008 [− 0,368–0,352], p > 0,99, siehe Abb. 2D).

CBD fördert ein Muster der entzündungshemmenden und antioxidativen stressbedingten Genexpression. Hirnregionen sowohl der stimmmotorischen (HVC und RA) als auch der Lernschaltkreise (Bereich X) wurden durch Mikrostanzung präpariert, Gesamt-RNA extrahiert, cDNA synthetisiert und PCR-amplifiziert. Die Genexpression von IL-1B, IL-6, IL-10, TNFα und SOD2 wurde auf die endogene Kontrolle (GAPDH) normalisiert und die Faltungsänderung gegenüber der nicht verletzten Hemisphäre wurde als 2−∆∆CT ausgedrückt. Zur Quantifizierung wurde cDNA von n = 5 pro Gruppe dreifach amplifiziert und der durchschnittliche Zyklusschwellenwert (Ct) berechnet. Der mittlere Ct-Wert wurde dann für die weitere Analyse verwendet. (A) CBD verringerte die mittlere Expression von proinflammatorischem IL-6 in HVC, RA und Area X signifikant. (B) CBD verringerte die mittlere Expression von IL-1Β in HVC und RA, jedoch nicht in Area war in HVC und RA verringert, jedoch nicht in Bereich X. (D) Die mittlere Expression des entzündungshemmenden Mediators IL-10 war in HVC und RA erhöht, in Bereich X jedoch nicht signifikant. Superoxiddismutase 2 (SOD2) war bei HVC und RA verringert. Beachten Sie, dass das Gewebe 24 Stunden nach der Verletzung gewonnen wurde und somit eine „Momentaufnahme“ der Expression entzündlicher Zytokine darstellt, die bekanntermaßen mit der Zeit nach der Verletzung variiert24. Gruppenunterschiede wurden durch gemischte ANOVA-Modelle mit der mehrfachen Vergleichskorrektur von Sidak bewertet.

Im Einklang mit der entzündungshemmenden Wirksamkeit hat sich gezeigt, dass CBD das Redoxgleichgewicht sowohl durch direkte als auch indirekte antioxidative Wirkung beeinflusst25. Die Expression von Superoxiddismutase 2 (SOD2), einem Gen, das das mitochondriale Protein SOD2 kodiert, das für die Bindung von Superoxidnebenprodukten verantwortlich ist, zeigte eine signifikante CBD-bedingte Abnahme innerhalb von HVC (mittlere Falte = 0,8768 [0,269–1,49], p = 0,002). und RA (mittlere Falte = 0,701 [0,093–1,31], p = 0,018), jedoch nicht im Bereich X (mittlere Falte = 0,4841 [− 0,124–1,092], p = 0,162, siehe Abb. 2E).

Um zu bestätigen, dass eine verminderte SOD2-Expression mit einer allgemeinen Abnahme des oxidativen Stresses einherging, verwendeten wir den Superoxidindikator Dihydroethidium (DHE, siehe Abb. 3). Bei Oxidation interkaliert DHE doppelsträngige genomische DNA und markiert Kerne mit roter Fluoreszenz. In der Vehikelgruppe stellten wir fest, dass Mikroläsionen die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) der DHE-Färbung innerhalb von HVC (im Mittel = 52.215 [26.635–77.796], p < 0,0001) und RA (um 49.460 [23.880–75.041], p < 0,0001) signifikant erhöhten ) und Fläche X (um 29.817 [4237–55.397], p = 0,0152 siehe Abb. 3A). Im Gegensatz dazu gab es keine signifikanten Unterschiede in der DHE-Färbung zwischen den nicht verletzten Hemisphären von mit Vehikel und CBD behandelten Tieren (Abb. 3B VEH ohne Läsion vs. CBD ohne Läsion 3a,b,e,f, I,j). (HVC, im Mittel = 1777 [23.803–27.358], p > 0,9999; RA, im Mittel = 2194 [− 27.775–23386], p > 0,9999; und Fläche X, im Mittel = 4280 [− 21.300–29.861], S = 0,9980). Beim Vergleich der DHE-Färbung in den verletzten Hemisphären von mit Vehikel und CBD behandelten Tieren reduzierte CBD die Intensitäten innerhalb von HVC (im Mittel = 33.153 [7573–58.734], p = 0,0056), RA (im Mittel = 30.998 [5417–56.578], p =). 0,0107) und Fläche X (Mittelwert = 28.089 [2508–53.669], p = 0,0250, siehe Abb. 3B). Darüber hinaus reduzierten CBD-Behandlungen beim Vergleich der Behandlungsgruppen mit ihren jeweiligen Kontrollgruppen ohne Läsionen die läsionsbedingten Veränderungen der DHE-Expression in allen Regionen signifikant (HVC im Mittel = 181,5 % [53,91–309,1], p = 0,0045; RA im Mittel = 143,6 % [16,04]. –271,2], p = 0,0248; und Fläche X im Mittel = 152,0 % [24,40–279,6], p = 0,0171 (siehe Abb. 3C).

CBD verringerte reaktive Sauerstoffspezies in verletzten Hemisphären, was durch die Intensität der Dihydroethidium-Färbung (DHE, in Rot) angezeigt wird. (A) Repräsentative konfokale Bilder, die regionale DHE-Färbung zeigen, die auf reaktive Sauerstoffspezies (ROS) als Funktion des Läsionszustands und der Behandlung hinweist. (B) Zusammenfassung der mittleren korrigierten Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) der DHE-Färbung in jedem Bereich unter Verwendung einer kreisförmigen Fläche mit einem Durchmesser von 0,5 mm (Details zur CTCF-Berechnung finden Sie unter Methoden). In der Vehikelgruppe erhöhten Mikroläsionen die Gesamtfluoreszenz der DHE-Färbung innerhalb von HVC, RA und Bereich X signifikant. Eine signifikant erhöhte läsionsinduzierte DHE-Färbung wurde in den mit CBD behandelten Gruppen nicht beobachtet. In allen Hirnregionen der verletzten Hemisphären war die DHE-Färbung in den mit CBD behandelten Gruppen im Vergleich zu den Kontrollen signifikant geringer. (C) Beim Vergleich der %-kontrolltransformierten Messwerte der DHE-Färbung in verletzten Hemisphären von mit Vehikel und CBD behandelten Tieren reduzierte CBD die Intensitäten in HVC, RA und Bereich X. Die CBD-Behandlung reduzierte läsionsbedingte Veränderungen der DHE-Expression in allen Regionen erheblich Prozentsatz ihrer jeweiligen Kontrollhemisphäre. Die mittleren Grauwerte wurden bestimmt und anhand der durchschnittlichen Intensität außerhalb jeder untersuchten Liedregion um Hintergrundfluoreszenz korrigiert. Es wurden Vergleiche durchgeführt und die Signifikanz mithilfe der Sidak-Korrektur für Mehrfachvergleiche nach ANOVA mit gemischten Modellen (n = 4 pro Gruppe) bestimmt.

Um zu bestätigen, dass CBD-induzierte entzündungshemmende und antioxidative Muster der Genexpression zu Veränderungen des funktionellen Proteinspiegels führen, verwendeten wir Immunfluoreszenzansätze. Wir haben die relative Immunfluoreszenz mithilfe von Antikörpern gemessen, die auf IL-6, IL-1B und IL-10 abzielen, und die Ergebnisse als Prozentsatz der nicht verletzten Hemisphären ausgedrückt (Abb. 4A–F; beachten Sie, dass die Selektivität der verwendeten Antikörper durch die Färbung einzelner vorherrschender erwarteter Banden unterstützt wird). Größe: siehe ergänzende Abbildung S6). CBD reduzierte die läsionsbedingte IL-6-Proteinexpression bei HVC (durchschnittlicher Prozentsatz = 128,9 % [62,32–195,4], p = 0,0001) und RA (um 89,37 % [22,84–155,9], p = 0,0063) signifikant. Abb. 4A, B). Für IL-1Β verringerte die CBD-Behandlung die Expression in HVC (Mittelwert = 131,2 % [53,55–208,8], p = 0,0007) und RA (Mittelwert = 115,0 % [37,36–192,6], p = 0,0026, Abb. 4C). ,D). Die Expression von IL-6, aber nicht von IL-1B, wurde in Bereich > 0,9999, Abb. 4B,D). CBD erhöhte das entzündungshemmende IL-10 bei RA signifikant (im Mittel = 54,9 % [9,388–100,4], p = 0,0147) und im Bereich X (im Mittel = 66,5 % [20,96–111,9], p = 0,0030), wohingegen dies nicht der Fall war statistischer Unterschied an der verletzten Stelle (HVC im Mittel = 21,4 % [− 66,85–24,14], p = 0,5612 Abb. 4E,F).

CBD verändert entzündungsbedingte Zytokindichten. Tägliche Behandlungen mit 10 mg/kg waren mit einer Modulation der IL-1Β-, IL-6- und IL-10-Proteinexpression 24 Stunden nach einseitigen HVC-Läsionen verbunden. Gezeigt werden repräsentative immunfluoreszierende konfokale Bilder der Antikörperfärbung, die auf IL-1Β, IL-6 und IL-10 in motorischen (HVC und RA) und lernrelevanten Regionen (Bereich X) abzielt. (Aa-Al), Bilder der verletzten Hemisphäre, die die repräsentative regionale Verteilung von IL-6 bei mit Vehikel vs. mit CBD behandelten Vögeln zeigen. (Ca–Cl), Bilder, die die regionale Verteilung von IL-1Β zeigen. (Ea-El), konfokale Bilder, die die regionale Verteilung von IL-10 zeigen. Repräsentative Bilder für die nicht verletzte Hemisphäre sind in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt. B, IL-6-Fluoreszenz als prozentuale Veränderung gegenüber der nicht verletzten Kontrollhemisphäre nach Gesangsregion und medikamentöser Behandlung. CBD reduzierte die IL-6-Expression in HVC, RA und Area CBD verringerte die IL-1Β-Intensität bei HVC und RA signifikant. F, entzündungshemmende IL-10-Fluoreszenz als prozentuale Veränderung gegenüber der nicht verletzten Kontrollhemisphäre nach Gesangsregion und medikamentöser Behandlung. CBD erhöhte die IL-10-Intensität bei RA und Area Die Image J-Software wurde verwendet, um Z-Stapel-Bilder zu analysieren, die mit maximaler Intensität projiziert wurden, und der Schwellenwert wurde konsistent auf alle Bilder für n = 5 pro Gruppe angewendet.

Die entzündungshemmende und antioxidative Wirkung von CBD lässt auf eine Beteiligung an der NRF2-vermittelten Regulierung von Redox-, Mitochondrien- und Entzündungsprozessen zur Aufrechterhaltung der Homöostase schließen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CBD-Behandlung die nuklearen pNRF2-Spiegel in allen interessierenden Regionen signifikant erhöhte: bei HVC (durchschnittlicher Prozentsatz = 19,6 [3,7–35,4], p = 0,0259), RA (durchschnittlicher Prozentsatz = 11,65 [2,39–20,9], p = 0,0262). ) und Fläche X (Mittelwert = 7,1 [1,8–12,43], p = 0,0218, Abb. 5B).

CBD erhöht die Kernlokalisation des Transkriptionsfaktors pNRF2, der die antioxidative Reaktion reguliert. (A): Bilder innerhalb der Gesangsregionen wurden aus Gewebe aufgenommen, das 24 Stunden nach einseitigen HVC-Läsionen gesammelt wurde. Die obere Reihe (af) zeigt die pNRF2-Färbung. Die untere Reihe (gl) zeigt die pNRF2-Färbung in Rot, verschmolzen mit der Hoechst-Kernfärbung in Blau. (B), pNRF2-Kernfärbung in interessierenden Songregionen, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Kernfärbung. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CBD-Behandlung den nuklearen pNRF2 in HVC, RA und Area X signifikant erhöhte, was mit antioxidativen Reaktionen übereinstimmt. Die Image J-Software wurde verwendet, um Z-Stapel-Bilder zu analysieren, die mit maximaler Intensität projiziert wurden, und der Schwellenwert wurde konsistent auf alle Bilder angewendet. Gruppenunterschiede wurden mithilfe einer ANOVA mit gemischten Modellen und anschließenden Sidak-korrigierten Post-hoc-Vergleichen für n = 4 pro Gruppe ermittelt.

Aktivierung, Rekrutierung und Phagozytose von Mikroglia sind primäre Entzündungsreaktionen nach einer Verletzung, die bekanntermaßen durch die Freisetzung von Zytokinen und die Produktion von Superoxid vermittelt werden und nachgelagerte Auswirkungen auf die Komplementkaskade haben26,27. Frühere Erkenntnisse verbinden die Mikroglia-Aktivierung mit einer vorübergehenden Erhöhung entzündungsfördernder Gene (z. B. IL-1Β und IL-6), die beim Höhepunkt des neuronalen Todes während einer Gewebeschädigung beobachtet wurden27. Angesichts unserer Ergebnisse, die eine erhöhte Expression entzündungsfördernder Zytokine 24 Stunden nach Mikroläsionsoperationen zeigten, untersuchten wir die Möglichkeit einer Mikrogliabeteiligung als Teil des Wirkmechanismus von CBD in unserem System. Unter Verwendung von TMEM119 als Mikroglia-Marker untersuchten wir die läsionsinduzierte TMEM119-Färbung in Songregionen (HVC, RA und Bereich X) und die Auswirkungen von CBD auf diese Expression (Abb. 6A). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die TMEM119-Spiegel in HVC, RA und Bereich ; um 87,39 % [17,37–157,4], p = 0,0123 (Abb. 6B). Beachten Sie, dass unser derzeitiger Fokus auf Mikroglia einen ersten Schritt darstellt und die wahrscheinliche Beteiligung anderer Zelltypen an mikroläsionsinduzierten Entzündungsreaktionen nicht ausschließt ( z. B. reaktive Astrozyten)28.

CBD-Behandlungen verringern die Dichte des Mikroglia-Markers TMEM119 in den Gesangsregionen verletzter Hemisphären. (aa-af), TMEM119-Immunfluoreszenz markiert Mikroglia, in denen in mit Vehikel behandeltem HVC, RA und Bereich X eine hohe Fluoreszenzdichte vorhanden ist. In der mit CBD behandelten Gruppe ist eine geringere TMEM119-Färbung erkennbar. (ag-al), Zusammenführen von Bildern von TMEM119 und Hoechst-gefärbten Kernen. (b) TMEM119-Dichte, ausgedrückt als mittlerer TMEM119-Grauwert relativ zur Hoechst-Färbung als Prozentsatz der nicht verletzten Hemisphäre. Innerhalb von HVC, RA und Area X waren die TMEM119-Dichten bei mit CBD behandelten Tieren im Vergleich zu Vehikelkontrollen deutlich niedriger. Gruppenunterschiede wurden mithilfe einer ANOVA mit gemischten Modellen und anschließenden Sidak-korrigierten Post-hoc-Vergleichen für n = 4 pro Gruppe ermittelt.

Zu einer kritischen Funktion der Mikroglia gehört die phagozytotische Beseitigung axonaler und synaptischer Trümmer nach neuronaler Degeneration29. Der Nachweis einer CBD-bedingten verminderten mikroglialen TMEM119-Expression veranlasste uns zu der Frage, ob Behandlungen auch die synaptische Dichte schützen. Um dies zu messen, verglichen wir die Kolokalisierung der prä- und postsynaptischen Marker VGLUT2 und PSD-95 über die Behandlungsgruppen hinweg (Abb. 7, 8, 9, 10). Wir sahen einen signifikanten läsionsbedingten Rückgang der Synapsendichten. In der Vehikelgruppe verringerten einseitige Mikroläsionen die synaptische Dichte innerhalb der HVC (Abb. 10, Veh ohne Läsion vs. Veh mit Läsion) im Mittel = 0,20/µm2 [0,025–0,38], p = 0,0272, RA im Mittel = 0,24/µm2 [0,11]. –0,37, p = 0,0014) und Fläche X im Mittel = 0,16/µm2 [0,007–0,31], p = 0,0410). Interessanterweise kam es innerhalb der RA von CBD-Gruppen zu einer signifikanten Abnahme der synaptischen Dichte nach der Läsion (CBD ohne Läsion vs. CBD mit Läsion im Mittel = 0,16/µm2 [0,022–0,30], p = 0,0234), während HVC- und Area-X-Veränderungen unbedeutend waren. Allerdings hatte die CBD-Behandlung einen tiefgreifenden Effekt auf die synaptische Dichte nach der Läsion im Vergleich zum Vehikel bei HVC (Veh-Läsioned vs. CBD-Läsioned, Mittelwert = 0,19/µm2 [0,002–0,38], p = 0,0476) bei RA (Mittelwert = 0,18/µm2). [0,05–0,32], p = 0,0088 und Fläche = 0,076/µm2 [− 0,1126–0,2654], p = 0,7154 und Fläche 0,30], p = 0,0234). Anschließend quantifizierten wir den Unterschied in der synaptischen Dichte von der nicht verletzten zur verletzten Hemisphäre als Anzahl der kolokalisierten Puncta als Prozentsatz der nicht verletzten Kontrollhemisphäre (Abb. 10B). Innerhalb von HVC und RA hatten CBD-Gruppen dies ein signifikanter Anstieg der synaptischen Dichte nach der Läsion (HVC im Mittel = 24,4 % [0,4095–48,41], p = 0,0,0464; RA im Mittel = 16,5 % [3,019–29,90], p = 0,0186), während sich Bereich X nicht unterschied signifikant (Mittelwert = 13,77 % [12,02–39,56], p = 0,3336). Auch wenn dies nicht als signifikant befunden wurde, könnte es wichtig sein, dass die CBD-Behandlung tendenziell die Synapsendichte in nicht verletzten Hemisphären im Vergleich zum Vehikel erhöhte, was auf eine Förderung der Synaptogenese zusätzlich zum Läsionsschutz hindeutet (Abb. 10A).

CBD-Behandlungen schützen glutamaterge Synapsendichten vor läsionsbedingten Verlusten innerhalb der HVC. (a–t) Repräsentative konfokale Bilder der Immunfluoreszenz, die die synaptische Dichte in vier Gruppen veranschaulichen: VEH ohne Läsion (a–e), CBD ohne Läsion (f–j), VEH mit Läsion (k–o) und CBD mit Läsion (p–t). Die Flecken werden entsprechend Hoechst, PSD95 (postsynaptischer Marker) und VGLUT2 (präsynaptischer Marker) in Spalten unterteilt. Spalte vier ist eine Zusammenführung von PSD95 und VGLUT2 und Spalte 5 zeigt eine Maske der kolokalisierten Puncta. Die Synapsenmasken zeigen, dass CBD-Gruppen im Vergleich zu VEH-Kontrollen 24 Stunden nach den Läsionen deutlich höhere glutamaterge Synapsendichten aufweisen.

CBD-Behandlungen schützen die glutamaterge Synapsendichte vor läsionsbedingten Verlusten bei RA. (a–t) Repräsentative konfokale Bilder der Immunfluoreszenz, die die synaptische Dichte in vier Gruppen veranschaulichen: VEH ohne Läsion (a–e), CBD ohne Läsion (f–j), VEH mit Läsion (k–o) und CBD mit Läsion (p–t). Der Fleck ist entsprechend Hoechst, PSD95 (postsynaptischer Marker) und VGLUT2 (präsynaptischer Marker) in Spalten unterteilt. Spalte vier ist eine Zusammenführung der beiden Färbungen und Spalte 5 zeigt eine Maske der kolokalisierten Puncta von PSD95 und VGLUT2. Die Synapsenmasken zeigen, dass CBD-Gruppen im Vergleich zu VEH-Kontrollen 24 Stunden nach der Läsion deutlich höhere glutamaterge Synapsendichten aufweisen.

CBD-Behandlungen schützen glutamaterge Synapsendichten vor läsionsbedingten Verlusten im Bereich o) und CBD-läsioniert (p–t). Der Fleck ist entsprechend Hoechst, PSD95 (postsynaptischer Marker) und VGLUT2 (präsynaptischer Marker) in Spalten unterteilt. Spalte 4 ist eine Zusammenführung der beiden Färbungen und Spalte 5 zeigt eine Maske der kolokalisierten Puncta von PSD95 und VGLUT2. Die Synapsenmasken zeigen, dass CBD-Gruppen im Vergleich zu VEH-Kontrollen 24 Stunden nach den Läsionen deutlich höhere glutamaterge Synapsendichten aufweisen.

CBD-Behandlungen schützen die glutamaterge Synapsendichte vor läsionsbedingten Verlusten. (a) Quantifizierung der synaptischen Dichte der Gesangsregion in nicht verletzten und verletzten Hemisphären von Vehikel- und CBD-behandelten Singvögeln. In der Vehikelgruppe verringerten einseitige Mikroläsionen die synaptische Dichte in allen drei untersuchten Regionen (HVC, RA und Bereich X). Im Gegensatz dazu gab es in der CBD-Gruppe keine signifikanten Läsionseffekte im HVC oder im Bereich X. Dieser Schutz war bei RA nicht so stark, obwohl das Defizit verringert war. Die CBD-Behandlung hatte einen tiefgreifenden Einfluss auf die synaptische Dichte nach der Läsion im Vergleich zu den Dichten nach der Läsion bei mit Vehikel behandelten Vögeln in allen drei Regionen von Interesse. (b) Läsionsbedingte Änderung der synaptischen Dichte, ausgedrückt als kolokalisierte Puncta, umgewandelt in den Prozentsatz der nicht verletzten Kontrollhemisphäre. Innerhalb der HVC- und RA-Gruppen kam es in den CBD-Gruppen zu einem signifikanten Anstieg der synaptischen Dichte nach der Läsion, während sich im Bereich X kein signifikanter Unterschied zeigte. Dies weist auf einen erheblichen Schutz der Synapsen in Schlüsselbereichen der Stimmproduktion hin. Zur Analyse wurde jeder Z-Stapel-Bildsatz nachbearbeitet und mit maximaler Intensität projiziert. Punkte von kolokalisiertem VGLUT-2 und PSD-95 innerhalb jeder Region wurden für die Partikelanalyse definiert, wobei der Schwellenwert ab n = 5 Tieren pro Gruppe angewendet wurde. Die glutamatergen Synapsendichten wurden dann als prozentuale Veränderung gegenüber der nicht geschädigten Kontrollhemisphäre quantifiziert. Die Signifikanz wurde bewertet und entsprechende Vergleiche wurden mithilfe der ANOVA mit gemischten Modellen und der Sidak-Korrektur für Mehrfachvergleiche durchgeführt.

Die Wiederherstellung der Stimme von Zebrafinken erfordert sensomotorisches Feedback14, was uns dazu veranlasste, Faktoren zu untersuchen, die Erfahrung mit Neuroplastizität und homöostatischer synaptischer Skalierung verbinden30. Durch Quantifizierung der Expression wichtiger plastizitätsbezogener Gene mittels qRT-PCR fanden wir signifikante Unterschiede in den Behandlungsgruppen in der Expression von BDNF (F[3, 36] = 28,79, p < 0,0001), MSK1 (F[3, 36] = 57,63, p < 0,0001) und ARC/ARG3.1 (F[3, 36] = 46,53, p < 0,0001, Abb. 11).

CBD beeinflusst die Expression synaptischer Skalierungsregulatoren. Y-Achsen = mRNA-Expression von BDNF, ARC/ARG3.1 und MSK1, normalisiert auf die Housekeeping-Kontrolle (GAPDH) und ausgedrückt als fache Änderung gegenüber nicht verletzten Hemisphären (2−∆∆CT). Die aus Gruppen von n = 4 Probanden synthetisierten cDNA-Proben wurden dreifach amplifiziert und die Mittelwerte aufgetragen. (a) Bei RA und Bereich X der verletzten Hemisphären erhöhte CBD die mittlere Expression von BDNF im Vergleich zu VEH-Kontrollen signifikant. (b) Bei HVC, RA und Bereich (c) Bei RA und Bereich X der verletzten Hemisphären unterdrückte CBD die ARC/ARG3.1-Expression im Vergleich zu VEH. Gruppenunterschiede wurden durch gemischte ANOVA-Modelle mit der mehrfachen Vergleichskorrektur von Sidak bewertet.

Post-hoc-Vergleiche ergaben, dass Läsionen bei VEH-Kontrollen die BDNF-Expression in HVC signifikant erhöhten (um das 1,29-fache, 95 %-KI = 0,66–1,92, p < 0,0001), nicht jedoch in RA oder Bereich X (Abb. 11A). Dies scheint mit der Stimulierung der BDNF-Expression in der verletzten Region (HVC) zusammenzuhängen, die sich nicht auf die Projektionsziele RA und Bereich in jeder Gehirnregion beobachtet (in HVC um 1,15, 95 %-KI = 0,52–1,78, p < 0,0001; in RA um 1,01, 95 %-KI = 0,38–1,64, p = 0,0007; in Bereich X um 1,02, 95 %-KI = 0,39–1,36, p = 0,0006).

Da es Hinweise darauf gibt, dass BDNF die MSK1-Expression in der erfahrungsbedingten synaptischen Plastizität erhöht31, untersuchten wir eine mögliche CBD-Regulierung der Expression dieser Kinase. Obwohl Läsionen dazu neigten, die MSK1-Expression in VEH-Kontrollen zu erhöhen, war dies nur in Bereich Im Gegensatz dazu hatten mit CBD behandelte Vögel eine signifikant erhöhte MSK1-Expression in jeder interessierenden Gehirnregion (bei HVC um 1,25, 95 %-KI = 0,81–1,66, p < 0,0001; bei RA um 1,08, 95 %-KI = 0,64–1,52, p). < 0,0001; im Bereich X um 1,01, 95 %-KI = 0,38–1,64, p < 0,0001).

In Modellen der homöostatischen synaptischen Skalierung erhöhen hohe Werte synaptischer Aktivität die Signalübertragung des BDNF/MSK1-Signalwegs32 und fördern die ARC/ARG3.1-Expression. Die ARC/ARG3.1-Aktivität fördert die Internalisierung erregender AMPA-Rezeptoren und verringert die erregende synaptische Stärke. Um zu testen, ob dieser ARC/ARG3.1-Signalweg durch die CBD-Behandlung in unserem System beeinflusst wird, haben wir die Auswirkungen der Behandlung auf die ARC/ARG3.1-Expression gemessen. Interessanterweise erhöhten Läsionen in jeder interessierenden Hirnregion der mit Vehikel behandelten Kontrollen die ARC/ARG3.1-Expression signifikant (bei HVC um 0,08, 95 %-KI = − 0,40–0,56, p = 0,970; bei RA um 0,56, 95 %-KI). = 0,079–1,04, p = 0,017; im Bereich X um 0,62, 95 %-KI = 0,14–1,11, p = 0,0068, Abb. 11C). Im Vergleich zu Vehikel- und CBD-behandelten Vögeln mit Läsionen war die Expression von ARC/ARG3.1 in RA und Area = 0,017 und; Fläche X um 0,62, 95 %-KI = 0,14–1,11, p = 0,007). Wenn ARC/ARG3.1 wie in anderen Systemen die Internalisierung von AMPA-Rezeptoren bewirkt, würden wir nach CBD-Behandlungen höhere Dichten erwarten. Wir prüfen derzeit diese Möglichkeit.

Diese Experimente wurden durchgeführt, um mögliche Mechanismen zu identifizieren, die zu der zuvor beobachteten Beschleunigung der Stimmerholung durch CBD nach HVC-Mikroläsionen beitragen könnten; und damit zu beginnen, die beteiligten Lern- und Motorregionen zu identifizieren. Der Wert der Untersuchung der CBD-Neuroprotektion bei Singvögeln liegt in der Fähigkeit, Prozesse zu identifizieren, die innerhalb diskreter Knoten von Schaltkreisen verändert werden, die das Lernen und die Stimmproduktion steuern. Stimmkontrollwege bei Singvögeln und Menschen weisen konvergente funktionelle Ähnlichkeiten auf, die die Übersetzungsrelevanz im Vergleich zu nicht stimmlernenden Arten erhöhen9,10. Ein deutlicher Unterschied zwischen den Stimmwegen von Vögeln und Menschen besteht in der nuklearen und nicht in der laminierten Organisation pallialer Stimmkontrollregionen. Dieser Unterschied bietet Vorteile bei der gezielten Ausrichtung auf Regionen zur Manipulation und räumlichen Beurteilung; Eine Funktion, die wir genutzt haben. Zusätzlich zu HVC (dem prämotorischen kortikal-ähnlichen Mikroläsionsziel) haben wir uns auf seine Projektionsziele konzentriert: RA (motorisch-kortikal-ähnliches Ziel) und; Bereich X (eine lernwichtige striatale Region, die auch pallidale Projektionsneuronen enthält). Da die Wiederherstellung des Gesangs von der sensomotorischen Integration abhängt, die von der Hörwahrnehmung abhängt (gehörlose Vögel verbessern sich nicht14), modelliert unser System auf einzigartige Weise den Verlust und die lernabhängige Wiederherstellung einer komplexen motorischen Fähigkeit bei Erwachsenen.

Die Ergebnisse zeigen, dass CBD im HVC-Mikroläsionsmodell starke antineuroinflammatorische Wirkungen hat, die denen entsprechen, die in Säugetiersystemen gut charakterisiert sind16 (siehe Abb. 2 und 4). Dies ist wichtig, da Neuroinflammation ein ätiologischer Faktor bei der Entwicklung eines Spektrums von ZNS-Erkrankungen ist33. Ein Beispiel ist eine chronische Neuroinflammation, die durch eine posttraumatische Hirnverletzung ausgelöst wird und die Wahrscheinlichkeit von Stimmungsstörungen und früh einsetzender Demenz erhöht34. Da zur Behandlung chronischer Neuroinflammationen eine chronische Verabreichung erforderlich ist, kommt es bei aktuellen Therapien häufig zu erheblichen Nebenwirkungen und/oder einer verminderten Wirksamkeit35. Die tiefgreifenden antineuroinflammatorischen Wirkungen, die wir und andere bei der Anwendung von CBD beobachtet haben, in Verbindung mit Hinweisen auf ein günstiges Nebenwirkungsprofil36 deuten darauf hin, dass es die Fähigkeit zur Bewältigung dieser schwierigen Erkrankung verbessern könnte.

Ein potenzielles Problem bei der therapeutischen Anwendung von CBD ist mangelnde Selektivität. Dieses Medikament interagiert mit mehreren zellulären Zielen und verändert deren Aktivität37,38. Ein weiteres Problem ist die Co-Isolierung anderer potenziell bioaktiver Moleküle. Gereinigte CBD-Extrakte enthalten zumindest Spuren anderer Cannabinoide, darunter ZNS-aktives THC39. Wir haben festgestellt, dass die Wirksamkeit von CBD durch den THC-Gehalt beeinflusst wird, was die Bedeutung konsistenter, sorgfältig kontrollierter Formulierungen unterstreicht40. Durch die Identifizierung von Signalwegen, die von der CBD-Behandlung beeinflusst werden, könnte es möglich sein, selektivere Medikamente zu identifizieren und so potenzielle Off-Target-Effekte zu reduzieren. Alternativ könnte eine Kombination aus den vielfältigen zellulären Interaktionen von CBD der Schlüssel zur Wirksamkeit und notwendig für den Neuroschutz sein. Das Mikroläsionsmodell ist vielversprechend für die Identifizierung antineuroinflammatorischer Mechanismen und das Screening potenzieller neuer Medikamente.

Die entzündungshemmenden Wirkungen von CBD waren in der mikroläsionierten Region (HVC) am stärksten und in zunehmend geringerem Maße in RA und Bereich X (z. B. Abb. 2A–C). Dies stimmt mit der Nähe zu HVC überein, was mit der erwarteten Auswirkung auf kürzere degenerierende Projektionen vor längeren Projektionen übereinstimmt (beachten Sie die Beweise für die Kupfer-Silber-Färbung hierfür in der ergänzenden Abbildung 7). Da RA die Ausgabe sowohl des mit Area Das AFP verfügt über eine fehlererzeugende Funktion, die eine für das sensomotorische Lernen entscheidende Stimmvariabilität einführt und die Aktivität sowohl in RA42 als auch in HVC moduliert (indirekt über dopaminerge Kerne des Mittelhirns43). Das Fortbestehen der AFP-Fehlergenerierung unter Bedingungen einer verminderten HVC-Motorsteuerung steht im Einklang mit einer durch Mikroläsionen verursachten Stimmstörung. Dies könnte erklären, warum bei Vögeln mit AFP-Mangel minimale Mikroläsionseffekte beobachtet werden11.

Eine weitere mögliche Erklärung für regionale Unterschiede in der entzündungshemmenden Reaktionsfähigkeit ist der zeitliche Ablauf dieser Prozesse, die oft koordiniert und sequentiell ablaufen44. Da wir nur einen einzigen 24-Stunden-Zeitpunkt untersucht haben, wissen wir nicht, ob die Reaktionen gerade erst begannen, endeten oder ihren Höhepunkt erreichten.

Ein zweiter identifizierter Mechanismus umfasste die Linderung von oxidativem Stress durch CBD, was durch die Auswirkungen auf die SOD2-Expression in HVC und RA angezeigt wird (Abb. 2E). Die Auswirkungen von oxidativem Stress wurden durch eine reduzierte Superoxid-aktivierte DHE-Färbung weiter bestätigt45 (Abb. 3). Wie bei Zytokinen variierte das Ausmaß der Superoxidproduktion mit der Nähe der Läsion, wurde jedoch durch CBD bei HVC und RA signifikant verringert (Abb. 3B). Beachten Sie, dass regionale Messungen der DHE-Fluoreszenz relativ zu umgebenden Regionen ausgedrückt werden und daher selektive Effekte innerhalb des Song-Schaltkreises zeigen.

Die Kombination aus entzündungshemmender und antioxidativer CBD-Aktivität deutete auf die Beteiligung einer organisierten Stressreaktion höherer Ordnung hin. Damit im Einklang steht die Signalübertragung, die von NRF2 gesteuert wird, einem etablierten zentralen Regulator von Redox-, Mitochondrien- und Entzündungsmediatoren. Unter basalen Bedingungen ist NRF2 ein zytoplasmatisches Protein, das bei oxidativem Stress durch Phosphorylierung aktiviert wird17. Aktiviertes Phospho-NRF2 wandert in den Zellkern, wo es als Transkriptionsfaktor fungiert und eine Vielzahl von Genen reguliert, die an antioxidativen, autophagischen, fehlgefalteten Protein- und anderen zellulären Reaktionen beteiligt sind46. Der in unserem System beobachtete signifikante CBD-bedingte Anstieg des nuklearen Phospho-NRF2 (siehe Abb. 5) deutet auf diesen homöostatischen Weg in unserem Modell hin. Die Tatsache, dass CBD wirksam beides bewirkt: (1) reduziert den oxidativen Stress, der typischerweise NRF2 aktiviert, und; (2) Eine erhöhte nukleare Translokation von pNRF2 deutet darauf hin, dass die antioxidative Aktivität von CBD entweder der pNRF2-Aktivierung nachgeschaltet ist oder dass CBD trotz reduzierter reaktiver Sauerstoffspezies (oder einer Kombination beider Möglichkeiten) in der Lage ist, NRF2 zu aktivieren. Zusätzliche Experimente zur Untersuchung zeitabhängiger Wirkungen von CBD werden notwendig sein, um die Natur der NRF2-Signalübertragung in diesem System zu klären. Beachten Sie, dass andere Aktivatoren der NRF2-Signalübertragung klinisch relevante entzündungshemmende Mittel sind47. NRF2 wird auch durch das pflanzliche Antioxidans Sulforaphan wirksam aktiviert, von dem ein Derivat derzeit bei ZNS-Blutungen untersucht wird48. Diese selektiveren Medikamente sind Kandidaten für die antineuroinflammatorische Bewertung im HVC-Mikroläsionssystem.

Die Art der proinflammatorischen Zytokinexpression, die wir nach Mikroläsionen beobachten (oben beschrieben), ist in anderen Systemen mit der Aktivierung, Infiltration und Phagozytose von Zelltrümmern von Mikroglia verbunden. Diese Aktivitäten können für die neuronale Erholung im Vergleich zur Apoptose von entscheidender Bedeutung sein26. Dies veranlasste uns, mögliche Mikroglia-bezogene Aktivitäten nach HVC-Mikroläsionen und einer durch CBD verbesserten Stimmerholung zu untersuchen. Beachten Sie, dass diese Untersuchung der Mikroglia-Beteiligung einen ersten Schritt darstellt. Es ist sehr wahrscheinlich, dass andere Zelltypen sowohl an der durch Läsionen verursachten Entzündung als auch an der entzündungshemmenden Aktivität von CBD beteiligt sind (z. B. reaktive Astrozyten)28. Derzeit sind Experimente mit zusätzlichen Markern geplant, die zu einer umfassenderen Charakterisierung der in unserem System aktiven und für unser System relevanten Zelltypen führen werden.

Derzeit haben wir bei der Verwendung von TMEM119 als Mikroglia-Marker49 festgestellt, dass CBD die Färbedichten deutlich reduziert, was mit einer verringerten Infiltration myeloider Zellen einhergeht (Abb. 6A, B). Dies ist interessant, da es darauf hindeutet, dass die schädigungsinduzierte myeloische Zellaktivität zu dem von uns untersuchten einzelnen frühen 24-Stunden-Zeitpunkt mit störenden Auswirkungen der Mikroläsionen und nicht mit der Neuroprotektion verbunden ist. Das abgerundete zelluläre Erscheinungsbild von TMEM119-gefärbten Zellen 24 Stunden nach der Läsion legt nahe, beweist jedoch nicht, dass Mikroläsionen die Dichte von Mikroglia in einem aktivierten phagozytischen Zustand erhöhen und dass CBD-Behandlungen dies reduzieren (wie in Abb. 6Aa-b gezeigt). In Zukunft wird es wichtig sein, einen umfassenderen zeitlichen Verlauf der Läsionseffekte zu untersuchen. Eine weitere Einschränkung ergibt sich aus jüngsten Erkenntnissen, die darauf hindeuten, dass TMEM119 Mikroglia möglicherweise nicht so zuverlässig von migrierenden peripheren Makrophagen unterscheidet wie bisher angenommen und dass es aktivierte von inaktiven Zuständen nicht unterscheidet50. Da Mikroglia ein Kontinuum von Aktivierungszuständen annehmen können: von entzündungsfördernden „M1-ähnlichen“ bis zu entzündungshemmenden „M2-ähnlichen“ Subtypen51 wird es in zukünftigen Studien wichtig sein, mehrere Marker zu messen, um die Arten und Aktivität myeloischer Zellreaktionen zu unterscheiden50 ,52. Im Gegensatz zu anderen CBD-bezogenen Maßnahmen kehrten sich die Auswirkungen auf die durch Läsionen erhöhte TMEM119-Dichte nicht auf nicht verletzte Kontrollwerte um (ergänzende Abbildung S4). Eine Hypothese, die wir derzeit testen, ist die Fähigkeit von CBD, die relativen Populationen von entzündungsfördernden zu entzündungshemmenden Mikrogliaarten zu verschieben.

Eine Schlüsselfunktion entzündungshemmender Mikroglia-Subtypen und anderer myeloischer Zellen28 bei der Genesung nach ZNS-Schäden ist die Erhaltung der synaptischen Dichte53. Der potenzielle Schutz/die Förderung der synaptischen Dichte durch CBD wurde durch Messung der Kolokalisierung von PSD95 und des präsynaptischen glutamatergen Markers VGLUT2 getestet (beachten Sie, dass HVC-Projektionen auf Bereich X und RA glutamaterg sind54). Wie erwartet schienen HVC-Mikroläsionen im Vergleich zu nicht verletzten Hemisphären die Dichte innerhalb der Region selbst und auch innerhalb ihrer Projektionsziele zu verringern (Abb. 7 und 10b, siehe auch Hinweise auf Kupfer-Silber-Degeneration [Ergänzende Abb. S7]). Weniger erwartet erhöhte CBD die Kolokalisierung synaptischer Marker in nicht verletzten Hemisphären im Vergleich zu VEH-Kontrollen, was auf eine Förderung der De-novo-Synaptogenese schließen lässt. Ob die synaptogene Aktivität mit einer zusätzlichen Synaptoprotektion einhergeht, bleibt eine offene Frage (Abb. 7, 8, 9). Das nach CBD-Behandlungen beobachtete verringerte Ausmaß der Stimmstörungen deutet auf einen möglichen Schutz der Schaltkreise hin, die beim Liedlernen entstehen. Die Erleichterung der Bildung neuer Synapsen könnte der CBD-Förderung der sensomotorischen, lernabhängigen Stimmwiederherstellung zugrunde liegen.

Ein Mechanismus, durch den CBD erregende Synapsen schützen kann, ist die Modulation der synaptischen Skalierung. Dieser homöostatische Prozess regelt die Synapsenempfindlichkeit unter verschiedenen Erregungszuständen55. Die synaptische Skalierung wird durch ein komplexes Netzwerk von Proteinen und Signalwegen reguliert, darunter BDNF, MSK1 und Arc/Arg3.132,56. BDNF aktiviert MSK1, das wiederum die Expression von Arc/Arg3.131 verändert. Arc/Arg3.1 reguliert direkt die synaptische Lokalisierung erregender AMPA-Rezeptor-Subtypen in einer Weise, die für den homöostatischen Schutz der lernbezogenen Plastizität und der Gedächtniskonsolidierung entscheidend ist57. Die Arc/Arg3.1-Aktivität erhöht die Internalisierung erregender AMPA-Rezeptoren, wodurch die erregende synaptische Stärke verringert und verringert wird. Diese Regulierung kann vor Exzitotoxizität schützen, aber in dem Maße, in dem Muster der AMPA-Rezeptor-Expression für die Aufrechterhaltung der beim Stimmlernen aufgebauten Gesangskreise wichtig sind, kann ein erhöhter Arc/Arg3.1 zu Stimmstörungen führen, die bei mit Vehikel behandelten Vögeln beobachtet werden. Die bei mit CBD behandelten Vögeln beobachteten verringerten Stimmstörungen können auf eine verminderte synaptische Skalierung nach läsionsbedingter Exzitotoxizität zurückzuführen sein (erkennbar an der CuAg-Färbung, ergänzende Abb. S7).

Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse starke entzündungshemmende und synaptoprotektive Mechanismen der CBD-Wirkung nach einer Schädigung einer prämotorischen kortikalen Region. Diese Wirksamkeit ist mit der Förderung mehrerer Homöostase-bezogener Mechanismen innerhalb der Gesangskreisläufe verbunden. Zukünftige Studien könnten diese Effekte mit einer zuvor nachgewiesenen lernabhängigen Stimmwiederherstellung in Verbindung bringen.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Materialien und Reagenzien von Sigma Aldrich oder Thermo Fisher bezogen. Botanisch gewonnenes CBD (≥ 98 %) wurde von GW Research Ltd, Cambridge, Großbritannien, bereitgestellt. Konzentrierte CBD-Vorräte wurden unter Verwendung von mit Stickstoff begastem 100 % ETOH hergestellt und bei –20 °C gelagert. Die Vorräte wurden dann mit Vehikel (2:1:17, ETOH:Alkamuls:PBS) verdünnt, um Suspensionen für Injektionen mit 10 mg/kg CBD herzustellen. Die resultierenden Ethanoldosen lagen bei 0,33 mg/kg – niedriger als die, die Zebrafinken freiwillig konsumierten58. Isofluran (Pivetal, NDC 46,066-755-03), das zur Anästhesie verwendet wurde, wurde von der Abteilung für Vergleichende Medizin der East Carolina University bereitgestellt.

CBD-Vorräte, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden in sterilen 5-ml-Fläschchen mit Septumverschluss bei 4 °C gelagert. Mindestens wöchentlich wurden frische Vorräte zubereitet. Für die Injektionen wurden Arzneimittelpräparate in sterile 1-cm³-Insulinspritzen mit 30-ga-Nadeln geladen. Am Morgen der Injektionen wurden die Vögel bei ausgeschaltetem Licht mit der Hand eingefangen und die Injektionsstelle des Brustmuskels freigelegt, indem Federn mit einer kleinen Menge 70 % ETOH aus einer Spritzflasche verfilzt wurden. In einen von vier Quadranten des Brustmuskels wurden täglich 50 µl Injektionen verabreicht, um mögliche Schäden durch wiederholte Behandlungen zu minimieren.

Die Experimente dauerten 8 Tage. Vor den chirurgischen Eingriffen wurden sechs tägliche IM-Injektionen von 15 μl verabreicht, um CBD, einem lipophilen Medikament mit großem Verteilungsvolumen und langer Eliminationshalbwertszeit, zu ermöglichen, sich dem Steady-State-Spiegel anzunähern59. Am 7. Tag erhielten die Vögel eine präoperative Injektion und es wurden einseitige Mikroläsionsoperationen gemäß den unten beschriebenen Methoden durchgeführt. Beachten Sie, dass einseitige HVC-Mikroläsionen die Lautäußerungen erheblich, aber vorübergehend stören, und zwar in einer Weise, die mit dem zuvor verwendeten bilateralen Ansatz übereinstimmt, mit der Ausnahme, dass das Ausmaß der Störungen vorhersehbar verringert wurde (siehe ergänzende Abbildung S1). Maximale Verhaltenseffekte einseitiger HVC-Mikroläsionen wurden 24 Stunden nach der Mikroläsion beobachtet, dem Zeitpunkt, der für die vorliegenden Experimente verwendet wird. Am achten Tag erhielten die Vögel morgens eine postoperative CBD-Injektion und wurden am Nachmittag zur RNA-Extraktion oder Perfusion und Isolierung von Paraformaldehyd-fixiertem Hirngewebe eingeschläfert. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Erwachsene männliche Zebrafinken (> 90 Tage alt) wurden in unserer Zuchtvoliere aufgezogen und bei 30 °C in einem 12/12-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Lieder zu produzieren, wurden ausschließlich Männer eingesetzt. Die Vögel wurden in Standard-Finkenkäfigen (9″ × 11″ × 17″) mit Futter und Wasser nach Belieben gehalten. Vögel wurden visuell, aber nicht akustisch isoliert, was mit früheren Experimenten in Aufnahmekammern übereinstimmt12. Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der East Carolina University genehmigt (siehe Ethikerklärungen unten) und diese Studie wurde gemäß den ARRIVE-Richtlinien60 durchgeführt und berichtet.

Um die Auswirkungen auf Tiere zu reduzieren und die statistische Aussagekraft zu verbessern, haben wir unser ursprüngliches bilaterales Mikroläsionsmodell12 geändert, um einen einseitigen Ansatz zu übernehmen, der es einzelnen Probanden ermöglicht, als ihre eigene interne Kontrolle zu dienen. Wir haben die linke Hemisphäre ins Visier genommen, da Hinweise darauf hinweisen, dass eine Lateralisierung ähnlich der Charakteristik der menschlichen Sprache ist61, was die Parallelen zwischen Sprache und Vogelgezwitscher weiter verdeutlicht (auch erste Optimierungsexperimente deuteten darauf hin, dass die HVC-Mikroläsion der linken Hemisphäre die Stimmqualität stärker störte als diejenigen, die auf die rechte Hemisphäre abzielten, siehe ergänzende Abbildung S1 ). Mit Ausnahme der bilateralen Modifikation wurden Mikroläsionen wie zuvor beschrieben durchgeführt12. Kurz gesagt, unter Verwendung eines MIDMARK VMS-Anästhesiesystems (91.800.003 VMS) wurden Vögel zunächst mit 3 % Isofluran (verdampft mit einem Sauerstoffträger bei einer konstanten Flussrate von 1,0 l/min) anästhesiert. Federn von der Ober- und Rückseite des Kopfes wurden entfernt und die Vögel wurden in einem stereotaktischen Instrument befestigt, wobei zwei Metallstäbe in den Gehörgang eingeführt und der Schnabel auf der Schnabelstange platziert wurde. An der Schnabelstange war ein 20-Gauge-Schlauch befestigt, um während des Eingriffs eine konstante Isofluranzufuhr zu ermöglichen. Als stereotaktischer Nullpunkt wurde die Bifurkation am Sinus midsagittalis verwendet. Kleine Kraniotomien wurden über dem linken HVC platziert (nach der Entfernung des Schädelabschnitts wurde die Isoflurankonzentration auf 2 % gesenkt). Für eine Zerstörung der linken HVC von etwa 8 % wurden zwei Stellen angepeilt: 2,4 und 2,8 mm vom stereotaktischen Nullpunkt bis zu einer Tiefe von 0,6 mm. Mikroläsionen wurden mit 100 µA für 35 s durchgeführt. Nach der Läsion wurde die Isoflurankonzentration vor dem Nähen auf 1 % gesenkt. Die Vögel erholten sich in einem warmen Brutkasten und wurden in die Aufnahmekammern zurückgebracht. Beachten Sie, dass diese Methoden von denen übernommen wurden, die ursprünglich von Thompson und Johnson, 200711, entwickelt wurden. Beachten Sie auch, dass unsere frühere Studie12, die die Wirksamkeit von CBD zur Verbesserung der Stimmwiederherstellung zeigte, ein bilaterales Läsionsmodell verwendete und nicht den hier verwendeten unilateralen Ansatz. Dies stellt eine Einschränkung dar, da wir nach unserer überarbeiteten, einseitigen Läsionsmethode keine Wirksamkeit von CBD zur Verbesserung der Stimmwiederherstellung nachweisen können. Daher stehen die Mechanismen, die wir im Zusammenhang mit der Wirksamkeit von CBD identifizieren, nicht in kausalem Zusammenhang mit dem vorherigen Nachweis einer verbesserten Stimmerholung.

Genexpressionsexperimente wurden mit drei biologischen Replikaten von vier bis fünf erwachsenen Zebrafinken pro Behandlungsgruppe durchgeführt. Für jedes Tier wurde ein steriles RNAse-freies Biopsie-Stanzwerkzeug mit 1 mm Durchmesser verwendet, um Hirngewebe von drei interessierenden Regionen aus jeder Hemisphäre herauszuschneiden (nicht verletzte rechte Seite diente als interne Kontrolle und verletzte linke Seite): HVC; RA; und Bereich X. Beispielbilder sind in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt. Gehirnproben wurden in TRIzol-Reagenz (Invitrogen, 15.596.026) homogenisiert, mit Chloroform getrennt und mit Isopropanol ausgefällt. Ausgefällte RNA wurde gewaschen und in RNase-freiem Wasser resuspendiert. Die RNA-Qualität wurde durch Gelelektrophorese bestätigt. Gesamt-RNA (250 ng) wurde zur Synthese von cDNA unter Verwendung eines iScript-Synthesekits (Bio-rad, 1.708.890) verwendet. Abgeschlossene Reaktionen wurden dreifach mit RNAse-freiem Wasser fünffach verdünnt. Die PCR wurde mit SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 1.725.271) durchgeführt. Die selektive Amplifikation wurde mithilfe einer Schmelzkurvenanalyse bestätigt und die Daten wurden als Zyklusschwellenwerte (Ct) mithilfe der CFX Manager-Software (Bio-Rad) ermittelt. Die Genexpression wurde auf die endogene Kontrolle (GAPDH) normalisiert und die Faltungsveränderung wurde anhand der nicht verletzten Hemisphäre unter Verwendung der ΔΔCt-Methode62 bestimmt. Primersequenzen und Informationen finden Sie in der Ergänzungstabelle S1.

Erwachsene männliche Zebrafinken (n = 3–5) erhielten 6 Tage lang medikamentöse Behandlungen, wurden am 7. Tag mit Mikroläsionen versehen und 24 Stunden später wurden transkardiale Perfusionen unter Verwendung von 4 % Paraformaldehyd zur Fixierung und 30 % Saccharose zum Kryoschutz durchgeführt. Fixierte Gehirne wurden an der Mittellinie blockiert, in OCT-Einbettungsmedium gelegt, mit einer Aufschlämmung aus 2-Methylbutan und Trockeneis eingefroren und dann mit einem bei –20 °C gehaltenen Kryostaten bei 10 µm geschnitten. Parasagittale Schnitte der rechten und linken Hemisphäre jedes Vogels wurden auf Superfrost Plus-Objektträgern montiert und bei –20 °C gelagert.

Die Objektträger wurden 1 Stunde lang bei 37 °C mit 5 % normalem Ziegenserum blockiert. Primärantikörper, die auf verschiedene Proteine ​​abzielen, wurden in 2 % normalem Ziegenserum verdünnt und in optimierten Konzentrationen verwendet: Anti-IL-6, 10 µg/ml (Biomatik, CAU30440); Anti-IL-1B, 10 µg/ml (Mybiosource, MBS 2.090.494); Anti-IL-10, 1:100 (BIOSS, AGO7251283); Anti-PSD95, 1:50 (Santa Cruz, SC-32291); antivesikuläres GLUT2 (VGLUT2) 1:500 (Cell Signaling, 715.555); Anti-TMEM119, 1:100 (Abcam, AB185337); antiphosphoryliertes NRF2 (pNRF2), 1:200 (Abcam, AB76026); und nukleare Gegenfärbung Hoechst, 1:10.000 (Thermo Fisher Scientific, H3570). Die Spezifität der primären Antikörper wurde durch Western Blot validiert. Die Bilder davon sind in der ergänzenden Abbildung S6 zusammengefasst. Alle Primärantikörper wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Objektträger mit PBS gewaschen und dann in entsprechendem Sekundärantikörper, verdünnt in 2 % normalem Ziegenserum, 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Sekundärantikörper waren Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus (A32723), Alexa Fluor 647 Ziegen-Anti-Maus (A32728) Alexa Fluor 647 Ziegen-Anti-Kaninchen (A32733). Nach einer Stunde Inkubation im Sekundärantikörper wurden die Objektträger zweimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Hoechst-Kerngegenfärbung. Nach dem vierten und letzten Waschgang wurden Deckgläser mit Diamant-Antifade-Eindeckmittel (Invitrogen, P36961) auf Objektträger gelegt. Kontrollreaktionen wurden ohne primäre Antikörper durchgeführt, um das Fehlen einer signifikanten unspezifischen Bindung sekundärer Antikörper zu zeigen (siehe Abb. S8).

Western-Blot-Analysen wurden durchgeführt, um die Spezifität der mit Zebrafinkengewebe verwendeten Primärantikörper zu bestimmen (siehe ergänzende Abbildung 6). Für jeden Blot wurden Proteinproben aus homogenisiertem Hirngewebe (Fisher Scientific, PowerGen 1000 S1) in RIPA-Lyse- und Extraktionspuffer (Thermo, 89.900) mit Proteaseinhibitor (Thermo, A32953) hergestellt. Nach der Homogenisierung wurde die Mischung 2 Stunden lang bei 4 °C auf einem Rotomix gerührt. Dann wurde das Gewebe 20 Minuten lang bei 4 °C und 16.000 g zentrifugiert, das Pellet wurde verworfen und der Überstand gesammelt. Lysepuffer mit Proteaseinhibitor wurde für jede Extraktion frisch hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde durch den Pierce-BCA-Assay (Thermo Fisher Scientific, 23.227) unter Verwendung von Lysepuffer als Verdünnungsmittel für den Assay und anschließenden Verdünnungen bestimmt.

Zur elektrophoretischen Trennung wurden 4 µL Precision Plus Dual Color Protein Ladder (Bio-Rad, Nr. 1.610.374) in Spur 1 eines 10 %igen Mini-PROTEAN TGX-Gels (Bio-Rad, Nr. 4.561.034) geladen, gefolgt von 20 µg Zebrafinken Gehirnprotein (denaturiert mit 4 × Laemmli-Ladepuffer bei 95 °C für 5 Minuten) in Spur 2. Die Elektrophorese wurde 75 Minuten lang bei konstanten 100 V durchgeführt. Das Protein wurde unter Verwendung eines Trans-Blot Turbo Systems (Bio-Rad, 1.704.150) auf eine mit Methanol aktivierte PVDF-Membran übertragen, wobei die Parameter durch das jeweilige Molekulargewicht bestimmt wurden. Die Membran wurde dann 3–4 Stunden lang bei 37 °C in filtriertem 5 % BSA in 0,1 % TBST blockiert. Der Blockierungspuffer wurde entfernt, 7 ml primärer Antikörper, verdünnt in 0,05 % TBST, hinzugefügt und dann über Nacht bei 4 °C auf einem Schüttler inkubiert. Die Antikörper wurden optimiert und die verwendeten Konzentrationen waren wie folgt: Anti-IL-6, 10 µg/ml (Biomatik, CAU30440); Anti-IL-1B, 2 µg/ml (Mybiosource, MBS 2.090.494); Anti-IL-10, 1:1000 (BIOSS, bs-0698R-TR); Anti-PSD95, 1:100 (Santa Cruz, SC-32291); antivesikuläres GLUT2 (VGLUT2) 1:1000 (Cell Signaling, 715.555); Anti-TMEM119, 1:200 (Abcam, AB185337); antiphosphoryliertes NRF2 (pNRF2), 1:1000 (Abcam, AB76026). Alle Verdünnungspuffer wurden vor der Verwendung frisch zubereitet. Am folgenden Tag wurde der primäre Antikörper entfernt und die Membran viermal jeweils 10 Minuten lang mit 0,1 % TBST gewaschen. Nach dem vierten Waschgang wurden die Membranen 1 Stunde lang in einem geeigneten Sekundärantikörper auf einem Wippschüttler bei 37 °C inkubiert. Sekundärantikörper waren IRdye 680RD Ziegen-Anti-Kaninchen 1:10.000 (Licor, 925–68.071) und IRdye 800CW Ziegen-Anti-Maus 1:10.000 (Licor, 925–32.210). Nach der Inkubation wurde der Sekundärantikörper entfernt und die Membran viermal jeweils 10 Minuten lang mit 0,1 % TBST gewaschen. Nach dem Waschen wurden Bilder mit einem Odyssey M Imager (Licor, M3350) aufgenommen.

Superoxidanionen wurden über 5 µM Dihydroethidium (DHE, Invitrogen, D11347) nach einem zuvor beschriebenen Protokoll63 nachgewiesen. DHE durchdringt Zellmembranen frei und reagiert mit zytosolischem Superoxid (O2−) unter Bildung von Ethidium, das bei DNA-Bindung rot fluoresziert. Diese Fluoreszenz kann dann quantifiziert werden64. Kurz gesagt, Gehirngewebe wurde schnell präpariert und in OCT-Verbindung unter Verwendung einer Trockeneis-2-Methylbutan-Aufschlämmung schockgefroren. Mit einem Gefriermikrotom (Epredia Microm HM525 NX Cryostat) wurden 10-µm-Schnitte geschnitten und auf Fisher Superfrost Plus-Objektträger montiert. Anschließend wurde 1 ml 5 µM in PBS verdünntes DHE vorsichtig auf jeden Objektträger pipettiert und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert vor Licht geschützt, zweimal mit PBS gespült und abgebildet.

Dunkelfeldbilder zur regionalen Identifizierung wurden mit der Image-Pro Plus-Software (Version 6.3) und einem Olympus BX51-Mikroskop mit einem Dunkelfeldkondensor bei 12,5-facher Vergrößerung aufgenommen (ergänzende Abbildung S2). Die Grenzen der interessierenden Regionen wurden aus Dunkelfeldbildern gezogen, um sie später über fluoreszierende konfokale Bilder zu legen. Zu den interessierenden Regionen gehörten HVC außerhalb von Infarkten, RA und Area X. Abschnitte, die Teile aller drei interessierenden Regionen enthielten, wurden identifiziert, um eine gleichmäßige Repräsentation aller Behandlungsbedingungen sicherzustellen. Fluoreszenzbilder wurden mit einem Zeiss-Laser-Scanning-Mikroskop (LSM, 700 Axio Observer) mit 40X- (Plan-Apochromat/1,4 Oil DIC M27) ​​und 10X-Objektiven (EC Plan-Neofluar/0,30 M27) ​​aufgenommen. Mit der Bildgebungssoftware Zeiss ZEN Black wurden Z-Stapelbilder aus 5 Schichten zusammengestellt und nach Überlagerung mit maximaler Intensität mit Image J analysiert.

Die Image J-Software wurde verwendet, um überlagerte Z-Stapel-Bilder zu analysieren, die in 8-Bit konvertiert wurden, wobei ein Schwellenwert konsistent auf alle Bilder in jeder Region angewendet wurde. Alle Bilddateien im CZI-Format wurden aus der ZEN Black-Software als Graustufen-TIFF-Dateien exportiert und in einer Z-Projektion mit maximaler Intensität konsolidiert. Für IL-6, IL-1B und IL-10 wurde der mittlere Grauwert der einzelnen Färbung im Verhältnis zur Hoechst-Kernfärbung nach Liedregion als Prozentsatz der Kontrollhemisphäre quantifiziert. Beachten Sie, dass rohe, nicht transformierte relative Fluoreszenzmessungen der Zytokinexpression sowohl für die geschädigte als auch für die nicht geschädigte Hemisphäre in der ergänzenden Abbildung S5 zusammengefasst sind. Für DHE wurden mittlere Grauwerte bestimmt und anhand der durchschnittlichen Intensität außerhalb jeder untersuchten Liedregion um Hintergrundfluoreszenz korrigiert (Abb. 3B). Die Gruppen wurden anhand eines Prozentsatzes der Kontrollhemisphäre verglichen (Abb. 3C). Die mittlere korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) wurde verwendet, um den Hintergrund mithilfe einer konsistenten kreisförmigen Fläche (kreisförmiger Durchmesser von 0,5 mm) zu eliminieren: CTCF = Integrierte Dichte – (mittlere Intensität der Liedregion * mittlere Hintergrundintensität). Zur Analyse der Kernlokalisation von pNRF2 wurde die Farbschwellenwertbestimmung verwendet, um Folgendes zu bestimmen: (1) die Fläche von pNRF2, die mit der Hoechst-Kernfärbung kolokalisiert ist, und (2) die Gesamtfläche der Hoechst-Kernfärbung. Die pNRF2-Kernfläche wurde dann als Prozentsatz der gesamten Kernfläche ausgedrückt und gruppenübergreifend verglichen (Abb. 4B). Zur Analyse des Mikroglia-Markers TMEM119 in jeder Region wurde der mittlere Grauwert der TMEM119-Färbung auf Hoechst-gefärbte Kerne normalisiert und als prozentuale Veränderung gegenüber der nicht verletzten Kontrollhemisphäre berechnet (Abb. 6B). Schließlich wurden die glutamatergen Synapsendichten mithilfe der Kolokalisation von VGLUT2 und PSD95 pro Messbereich (Kreisdurchmesser von 100 µm) bestimmt.

Die Tiere wurden gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee der East Carolina University (ECU-IACUC) genehmigten Protokollen verwendet. ECU-IACUC beaufsichtigt eine registrierte Forschungseinrichtung gemäß dem Tierschutzgesetz (Nr. 55-R-0010) und verfügt über eine vom Office of Laboratory Animal Welfare D16-00,294 genehmigte Tierschutzerklärung. Darüber hinaus verfügt ECU weiterhin über die vollständige Akkreditierung durch die Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Es wurde bestätigt, dass diese Arbeit mit Tieren, insbesondere erwachsenen männlichen Zebrafinken, allen ARRIVE-Richtlinien60 entspricht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Planung des Experiments und die Durchführung der genehmigten Forschung sowie das Verfassen und Überprüfen des Manuskripts, um sicherzustellen, dass alle Informationen verfügbar und leicht zugänglich sind.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 9.2.0 für alle histologischen Daten, Verhaltensdaten und Genexpressionsdaten durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer ANOVA mit gemischten Modellen und anschließender Post-hoc-Analyse von Sidak durchgeführt, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu identifizieren. Ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Statistische Ergebnisse sind im Text und in den Abbildungslegenden angegeben.

Die während der aktuellen Studie verwendeten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie, Brody School of Medicine der East Carolina University, Greenville, NC, 27834, USA

Mark Tripson und Ken Soderstrom

Abteilung für Anatomie und Zellbiologie, Brody School of Medicine, East Carolina Diabetes and Obesity Institute, East Carolina University, Greenville, NC, 27834, USA

Karen Litwa

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MT, KS und KL konzipierten und gestalteten Experimente, analysierten Daten und halfen bei der Überarbeitung des Manuskripts. MT führte die Experimente durch und verfasste das Manuskript. Alle Autoren haben diesen Bericht gelesen und maßgeblich dazu beigetragen.

Korrespondenz mit Ken Soderstrom.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tripson, M., Litwa, K. & Soderstrom, K. Cannabidiol hemmt neuroinflammatorische Reaktionen und den schaltkreisbedingten synaptischen Verlust nach einer Schädigung der prämotorischen kortikalen Stimmregion eines Singvogels. Sci Rep 13, 7907 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34924-z

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Eingegangen: 09. Februar 2023

Angenommen: 10. Mai 2023

Veröffentlicht: 16. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34924-z

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